Bjb123

作者：张强波　李杰　时昌文　李捷　孙京杰　曹莉莉
【摘要】 目标：观察多西环素（Doxycycline）对人肝细胞性肝癌细胞系HepG2发展按捺和凋亡的感化，并初步商量其感化机制。编制：不合浓度的Doxycycline（5、10、20、30和50 mg/L）对体外培育人肝癌细胞系HepG2进行不合的时候干预（24、48和72 h），MTT法测定细胞发展按捺率，TUNEL法检测细胞凋亡率，免疫细胞化学检测Fas、FasL及MMP-2蛋白表达的改变。结果：Doxycycline感化HepG2细胞48 h和72 h后，细胞发展被明显按捺，与无药对照组对照差别有统计学意义（P<0.001），且呈时候、浓度依靠趋势。其细胞凋亡率较无药对照组也明显升高（P<0.01）；20 mg/L Doxycycline感化于癌细胞48 h后，实行组FasL蛋白阳性表达较无药对照组明显升高，MMP-2蛋白阳性表达较无药对照组明显降低，两组差别均有统计学意义（P<0.01），而Fas蛋白表达则差别无统计学意义（P>0.05）。结论：Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2具有明显的发展按捺和促凋亡感化，其机制可能与下调MMP-2、上调FasL从而启动Fas/FasL膜受体路子有关。
【关键词】 肝肿瘤·Doxycycline·细胞凋亡·FasL·MMP-2
【ABSTRACT】Objective: To observe the effect and mechanism of doxycycline on cell growth inhibition and the apoptosis of human hepatoma cell HepG2 in vitro. Methods: HepG2 cells were treated with doxycycline at different concentrations and time in vitro. Cell growth inhibition rate was detected by MTT assay, and apoptosis rate was identified by TUNEL assay, the expression of Fas, FasL and MMP-2 proteins were examined by immunocytochemical staining. Results: Treated with doxycycline at different concentrations （5，10，20，30 and 50 mg·L-1） for 48 and 72 hours, the growth of HepG2 cells decreased significantly （P<0.001） and there was a tendency of dose-time dependent manner. Incubated HepG2 cells with doxycycline at 20 mg·L-1 for 48 hours, the expression of FasL were up-regulated and MMP-2 were down-regulated compared with those of control group （P<0.01）, while the difference of Fas expression was insignificant （P>0.05）. Conclusion: Doxycycline might inhibit cell growth and induce apoptosis of HepG2 significantly. The mechanism of doxycycline induced apoptosis might be associ
　　多西环素（Doxycycline）为四环素类抗生素的一种，已有研究注解其对前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌等多种肿瘤发展有明显的按捺感化［1-3］，而其对人肝癌细胞的发展按捺感化国表里未见报道。本研究观察了Doxycycline对人肝癌细胞系HepG2的发展按捺和凋亡的影响，并初步商量其感化机制。
1　材料与编制
1.1　实行材料　人肝细胞性肝癌细胞系HepG2购自美国典型物保藏中间细胞库，用含10%胎牛血清的RPMI1640培育基，37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱内常规培育，每日倒置显微镜观察细胞发展景遇，3d换液，合时0.25%胰酶消化传代。四甲基偶氮唑盐（MTT）、DMSO和Doxycycline均购自Sigma公司，TUNEL凋亡检测试剂盒购自Roche公司，FasL兔多克隆抗体及MMP-2鼠单克隆抗体购自SANTCRUZ公司，Fas鼠单克隆抗体购自北京中猴子司。
1.2　编制
1.2.1　MTT法检测肿瘤细胞发展能力　取对数生经久HepG2细胞，配成1.5×105 mL-1的单细胞悬液，96孔培育板每孔到场200 μL细胞悬液约3×104细胞，细胞常规培育4 h，贴壁后每孔从新到场含不合浓度Doxycycline的培育液2 μL，使其终质量浓度约拜别为5、10、20、30和50 mg/L，每个药物浓度设5个孔。同时设无药对照组5孔，无细胞培育液1孔（调零孔）。37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱内常规培育24、48和72 h，拜别取培育板MTT法计较药物感化后的吸光度（optical density,OD）。按以下公式计较细胞发展按捺率：
1.2.2　TUNEL检测细胞凋亡　取对数生经久发展优胜的HepG2细胞，将其拜别接种于200 mL培育瓶中，细胞贴壁后替代成含终质量浓度拜别为5mg/L和20 mg/L Doxycycline的前提培育液感化24、48和72 h。胰酶消化各组细胞后，取1滴细胞悬液于已消毒载玻片上，细胞贴壁发展4 h制成细胞爬片，用1∶1甲醇丙酮固定30 min,留存备用。按TUNEL试剂申明书（Roche）操作，采用倒置荧光鲜微镜成像，随机拔取5个视野300个细胞计较细胞凋亡率。
1.2.3　细胞免疫组织化学法检测FasL、Fas及MMP-2蛋白的表达　应用前述编制建造细胞爬片，拜别到场FasL、Fas及MMP-2一抗，用SABC法进行细胞免疫组织化学染色，DAB显色。
1.3　判定标准　FasL、Fas及MMP-2蛋白定位于细胞膜和（或）细胞质，阳性反映为细胞膜和（或）细胞质内着棕黄色颗粒。免疫组织化学结果剖断参照文献［4］，以阳性细胞百分比及着色强度计分做半定量理会。随机观察5个高倍视野，凭证阳性细胞数占细胞总数的百分比计为0～4分：无阳性细胞为0分，<25％为1分，26％～50％为2分，51％～75％为3分，>75％为4分；染色的深度以多半细胞的显色反映为准，着色强度计0～4分：无色为0分，淡黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分，棕褐色为4分。将上述两项指标的评分相加。每张片拜别由2个观察者进行盲法测定，最后取两观察者所得平均值。
1.4　统计学措置　利用SPSS11.0统计软件，多组数据间的对照采用单身分方差理会或自力样本t考验，P<0.05为差别有统计学意义。

2　结果
2.1　Doxycycline对HepG2细胞发展的按捺感化 　不合浓度Doxycycline感化于HepG2细胞24、48和72 h后，各组OD值见表1，个中24 h各实行组OD值与对照组比拟差别无统计学意义（F=1.15,μ>0.05），48h和72 h组较对照组均泛起了不合程度的发展按捺感化（F=102.9,F=176.7;P<0. 01），并呈明显的时候和浓度依靠性（图1）。
2.2　Doxycycline对HepG2细胞凋亡的影响　本研究选用5、20 mg/L两个药物浓度观察其对HepG2细胞凋亡的影响,在24 h后各组凋亡率差别无统计学意义（P>0.05），而在感化48、72 h后各实行组细胞凋亡率较对照组明显增添，P<0.01（表2，图2）。
2.3　Doxycycline对HepG2细胞FasL、Fas及MMP-2蛋白表达的影响　本研究选用20 mg/L Doxycycline感化HepG2细胞观察对FasL、Fas及MMP-2三种蛋白表达的影响，感化48 h后，FasL、Fas及MMP-2三种蛋白表达见表3。个中FasL蛋白表达积分较对照组明显增添(图3)，MMP-2蛋白表达积分较对照组明显降低(图4)，而Fas蛋白表达与对照组比拟差别无统计学意义，P>0.05(图5)。
3　接头
　　Doxycycline是一种化学润饰的四环素类抗生素，近年来，有关其对肿瘤发展按捺感化的研究报道已被遍及存眷。Cakir等［５］发现5、10 mg/L Doxycycline对狗骨肉瘤细胞的发展按捺率拜别为50%和72%，Bettany等［6］研究发现Doxycycline可以诱导兔破骨细胞的凋亡。本实行结果显示，5~50 mg/L浓度Doxycycline对HepG2细胞具有显著的发展按捺感化，并且呈现明显的剂量和时候依靠性。Doxycycline可促进HepG2细胞凋亡，跟着药物浓度及感化时候的增添，细胞凋亡率亦响应升高，提示Doxycycline对人肝细胞肝癌细胞系HepG2具有明显的促凋亡感化，进而可按捺肿瘤细胞的发展。
　细胞凋亡是一个对照复杂的过程，可通过多条启动路子实现，个中膜受体路子（Fas/FasL）是最首要的路子之一。Liu J等［7］发现Doxycycline可通过Fas/FasL介导的膜受体路子诱导T淋巴细胞凋亡，比来研究报道Doxycycline能够明显按捺人胰腺癌细胞增殖，并证实其首要通过Caspase依靠的细胞凋亡施展感化［3］。有报道注解人肝癌细胞系HepG2外面Fas有较强的表达［8］。本研究结果显示20 mg/LDoxycycline感化HepG2细胞48 h后FasL蛋白表达明显增添，与对照组对照差别有统计学意义（P<0.05），而Fas蛋白表达差别无统计学意义（P>0.05）。提示Doxycycline可能通过上调细胞外面FasL的表达而启动Fas/FasL介导的信号传导路子诱导细胞凋亡。
　　有报道Doxycycline作为MMP按捺剂，具有按捺胶原酶和其他MMP的感化［1,5,9］。体表里实行发现，Doxycycline对前列腺癌、乳腺癌及骨肉瘤均有明显的按捺感化，并证实它可按捺MMPs的表达及活性，从而按捺肿瘤的发展［1-2,9］。MMPs可通过多种路子调控肿瘤发展，亦可通过降解基底膜及启动血管内皮细胞发展来促进肿瘤增进及转移［10］，还可通过降解FasL以削减肿瘤细胞的凋亡［11］。本研究结果显示，20 mg/L Doxycycline感化HepG2细胞48 h后，实行组MMP-2表达阳性率与对照组对照明显降低（P<0.05）。推想Doxycycline按捺体外HepG2细胞发展感化可能通过降低MMP-2表达，从而削减FasL的降解,增添其表达，进而启动Fas/FasL膜受体路子来促进细胞的凋亡。
　　药物对肿瘤的按捺感化机制往往是多方面、多路子的，同样Doxycycline通过何种路子影响细胞FasL及MMP-2表达，其具体机制尚不完全清楚，有待做更进一步的实行研究和机制商量。但初期的体外研究获得了较幻想实行结果，有望为肝癌的临床诊治追求一种新的药物治疗。
【参考文献】
[1] Fife RS, Sledge GW Jr. Effects of doxycycline on cancer cells in vitro and in vivo[J]. Adv Dent Res, 1998, 12（2）:94-96.
[2] Fife RS, Sledge GW Jr, Roth BJ, et al. Effects of doxycycline on human prostate cancer cells in vitro[J]. Cancer Lett, 1998 ,127（1-2）:37-41.
[3] Mouratidis PX, Colston KW, Dalgleish AG. Doxycycline induces caspase-dependent apoptosis in human pancreatic cancer cells[J].Int J Cancer, 2007,120（4）:743-752.
[4] 刑传平,刘斌,董亮.免疫组织化学符号结果的判定编制[J]．中华病理学杂志，2001，30（4）：318。
[5] Cakir Y, Hahn KA． Direct action by doxycycline against canine osteosarcoma cell proliferation and colloagenase（MMP-1）activity in vitro[J]. In Vivo, 1999,13（4）：327—331．
[6] Bettany JT, Peet NM, Wolowacz RG， et a1． Tetracyclines induce apoptosis in osteocoasts[J]. Bone, 2000, 27（1）：75—80．
[7] Liu J, Kuszynski CA, Baxter BT. Doxycycline induces Fas/Fas ligand-mediated apoptosis in Jurkat T lymphocytes[J].Biochem Biophys Res Commun, 1999,260（2）:562-567.
[8] Masato Nakamura, Hiroaki Nagano, Sakon M, et al. Role of the Fas/FasL pathway in combination therapy with interferon-αand fluorouracil against hepatocellular carcinoma in vitro[J]. Journal of Hepatology, 2007,46（1）:77-78.
[9] Fife RS, Rougraff BT, Proctor C, et al. Inhibition of proliferation and induction of apoptosis by doxycycline in cultured human osteosarcoma cells[J]. J Lab Clin Med, 1997,130（5）:530-534.
[10] Bergers G, Brekken R, McMahon G, et al. Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis[J]. Nat Cell Biol, 2000,2（10）:737-744.
[11] Mitsiades N, Yu WH, Poulaki V, et al. Matrix metalloproteinase-7 mediated cleavage of Fas ligand protects tumor cells from chemotherapeutic drug cytotoxicity[J]. Cancer Res, 2001,61（2）:577-581.